GSEA softwareの使い方 〜発展編〜
100827版
前回は、Gene Set Enrichment Analysisを行うソフトウェアである GSEA software の導入と基本操作を解説しました。
今回は、NCBI GEOより取得した公共の遺伝子発現データを、表計算ソフトを使い加工し、GSEA softwareに読み込ませ解析を行う手順を解説します。
GSE1657:Adipocyte Differentiation[Homo sapiens]が今回使う遺伝子発現データです。脂肪細胞の分化前後の遺伝子発現データが公開されています。
今回はこのデータのうち、未分化のサンプル3種と分化したサンプル3種の発現データをGSEA softwareで解析します。
ダウンロードした発現データのファイルです。
表計算ソフトにドラッグして、データを読み込みます。
これをGSEA softwareが読み込むことのできるフォーマットに加工する必要があります。
フォーマットはhttp://www.broadinstitute.org/cancer/software/gsea/wiki/index.php/Data_formatsから参照できます。
列の幅が広すぎて見づらいので、修正します。
使用しないデータの列を消します。
ファイルの先頭の無関係な行を削除します。
末尾の余分な行も削除します。
Descriptionを記入する列を挿入します。
1行B列のセルには「Description」と記入します。2行目以下B列のセルには「na」と記入します。
1行A列のセルには「Name」と記入します。
加工が終わりました。全てコピーしメモ帳などのエディタに貼り付け、txtファイルに保存します。
GSEA software GUI版の画面に移動しました。まずは先程のファイルを読み込みます。
「Load data」内の「Browse for files」から読み込みます。
ファイルの読み込みに成功しました。ここでエラーが出る場合、読み込んだファイルのフォーマットが正しくない可能性があります。
「Run GSEA」をクリック！
「Expression dataset」は先程読み込んだファイルを選びます。
「Gene sets database」は遺伝子セット群を指定します。今回は予めGSEA softwareに用意されている「c5.bp.v2.5.symbols.gmt」を選択します。（Gene Ontology タームにより分類された遺伝子セット群 ）
「Phenotype labels」は、「Create an on-the-fly phenotype」をクリックしてその場で作成します。
ここでデータの表現型・種類を指定します。今回は左側に未分化のサンプルのデータを右側に分化後のサンプルのデータを指定します。
データは、先ほどのファイルの一行目の文字列で指定します。
改行で区切って入力します。
この入力欄では、右クリックメニューが機能しないので、Ctrl + V で貼りつけする必要があります。
同様に分化後のサンプルのデータも指定します。
「Enter a Brief name ...」欄に、サンプルの表現型・種類を記入します。今回は ’Undifferentiated’ と ’Differentiated’とします。
「Apply to dataset」=>「了解」=>「Close」とクリック！
ここが「Undifferentiated vs Differentiated」となっていることを確認し「OK」をクリック！
自分で作成したファイルをGSEA softwareに読み込ませて「Phenotype labels」として使用することも可能です。その場合は表現型・条件を3個以上指定したり、連続的な条件（経過時間など）を指定できます。
詳しくは、http://www.broadinstitute.org/cancer/software/gsea/wiki/index.php/Data_formatsを参照してください。
「Chip platform」は・・・
今回、発現データのファイルの一列目にはAffymetrix社のHGU133AのProbe idが記入されているので、HG_U133A.chipを選択します。
「Run」をクリックして解析を開始します。「Status」が「Success」になったらクリックして結果を閲覧します。
「Enrichment in phenotype: Differentiated」の結果から分化後のサンプルでスコアの高い遺伝子セットを閲覧します。
「Enrichment results in html」をクリック！
「FATTY_ACID_METABOLIC_PROCESS」などの遺伝子セットのスコアが高くなっています。
今度はADIPOQ遺伝子の発現と相関のある遺伝子セットを調べます。ADIPOQ遺伝子は、脂肪細胞が分泌するアディポネクチンをコードする遺伝子です。
「Expression dataset」と「Gene sets datavase」、「Permutation type」、「Chip platform」は前回と同様に設定します。
「Phenotype labels」から、「Use a gene as the phenotype」をクリック！
「Dataset」は「Expression dataset」欄と同じデータを指定します。
ADIPOQ遺伝子に対応するProbe idである「207175_at」を選択します。
「Apply to dataset」=>「了解」=>「Close」とクリック！
ここが「207175_at」となっていることを確認し「OK」をクリック！
それぞれのサンプルのADIPOQの発現量を「Phenotype labels」として指定できました。これは離散的ではなく連続的な量なので設定を少し変更する必要があります。
「Basic fields」の横の「Show」をクリック！
「Metric for ranking genes」を「Pearson」にします。
これで設定は終わりです。解析を開始します。
「Enrichment in phenotype: positive correlation ...」からADIPOQ遺伝子の発現と正の相関がありスコアの高い遺伝子セットを閲覧しましょう。
表示されました
最後に「Run GSEA」の重要な設定項目を解説します。
「Permutation type」は解析の有意性を計算する方法に関係します。データが6〜7サンプル以上の場合は「phenotype」が推奨されています。
今回は6サンプルのデータだったので「phenotype」を選択しました。
「Max size」「Min size」では、計算に使用する遺伝子セットの最大遺伝子数と最小遺伝子数を指定します。この範囲に入らない遺伝子セットは除外されます。
「Metric for ranking genes」では発現の変化を数値化する方法を指定します。
与えたデータが対数スケールであるか、与えた表現型・条件が連続的であるか離散的であるかを考慮して選択する必要があります。
詳しくは、http://www.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideTEXT.htm#_Metrics_for_Rankingを参照してください。
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